吉富罗非鱼(Genetically Improved Farmed Tilapia，GIFT)是由国际水生生物资源管理中心(ICLARM)通过4个非洲原产地直接引进的尼罗罗非鱼品系(埃及、加纳、肯尼亚、塞内加尔)和4个在亚洲养殖比较广泛的尼罗罗非鱼品系(以色列、新加坡、泰国、中国台湾)，经混合选育获得的优良品系(Eknath et al.,1993)。我国现有吉富罗非鱼主要是上海水产。

大学于1994年6 月和9月分两批从菲律宾引进的第3代吉富罗非鱼的后代，经过多代选育后，2006年经全国水产原种和良种审定委员会确认为罗非鱼新品种(李思发, 2001, 吉富品系尼罗罗非鱼引进史, 中国水产, 10: 52-53; 李思发和蔡完其, 2008, “新吉富”罗非鱼品种特点和养成技术要点, 科学养鱼, 5(20): 21-22)。吉富罗非鱼具有生长快、产量高、食性广、适应环境能力强以及肉质鲜美等优点，现已在全国范围内广泛养殖，成为我国重要的淡水养殖品种之一。因此，对吉富罗非鱼群体进行检测和遗传分析，揭示其群体的遗传多样性及种间遗传差异，对吉富罗非鱼良种培育和分子标记辅助育种都具有重要意义。

荷兰科学家Zabeau和Vos (Zabean,1993)于1993年建立了一种新的检测DNA多态性的分子标记技术-扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)技术。该技术具有所含信息量大、灵敏度高、符合孟德尔遗传等特点，且不需要预先明确研究对象的遗传背景，因此被广大研究人员所青睐，在生物学的各个领域已得到广泛的应用。目前，AFLP标记已在遗传多样性分析、遗传图谱的构建、基因的定位及分析、种质资源鉴定等方面得到广泛的应用。杨凇等(杨淞等,2006)已利用AFLP技术对橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼的种群进行了遗传多样性分析，研究表明2个罗非鱼种群的遗传多样性均比较丰富,且橙色莫桑比克罗非鱼种群内遗传多样性相对更丰富些。李莉好等(李莉好等,2007)已利用AFLP技术对吉富罗非鱼不同选育群体的遗传多样性进行了分析，结果表明吉富罗非鱼具有进一步选育的潜力。Kocher等(Kocher et al.,1998)和Jeremy等(Jeremy et al.,2000)利用AFLP 标记分别构建了不同来源的罗非鱼遗传图谱。本文利用AFLP技术对吉富罗非鱼群体(F₁₆)进行遗传分析，为吉富罗非鱼的后续选育提供理论依据。

1 结果与分析

1.1 DNA提取、酶切、预扩增结果

    部分吉富罗非鱼基因组DNA，以及经EcoRⅠ和MseⅠ双酶切，AFLP预扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳结果见图1-3。

1.2 AFLP选择性扩增结果

利用筛选的5对引物组合对吉富罗非鱼F₁₆基因组DNA进行择性扩增后进行电泳，得到的得到的部分电泳结果如图4：

1.3 数据分析结果

 利用引物组合E-AGG/M-CTT、E-AGG/M-CTG、E-AAC/M-CAG、E-ACA/M-CTG、E-ACA/M-CAG对吉富罗非鱼F₁₆中个体进行AFLP扩增,27个个体共扩增出了187个位点,每对引物组合扩增的位点数在32-55之间，平均每对引物扩增出37.4个位点，其中多态性位点163个，多态位点比例为87.17%。其中，E-AGG/M-CTT检出条带数最多为55条，E-AAC/M-CAG检出条带数最少为32条。多态位点比例最高的引物组合是E-AGG/M-CTT，为100.00%，最低的引物组合是E-AGG/M-CTG，为73.53%，如表1所示。AFLP遗传标记符合孟德尔遗传定律(Lerceteau and Szmidt,1999)，因此可以将1个扩增片段作为1个基因，1个个体的扩增片段组合即可视为此个体的基因型。表1所示，5对引物组合所检出的基因型与实验标本数目相一致，即每个个体的扩增图谱都与其他个体的有差异，所用引物组合能有效检出这种差异。

用Pop-Gene对检测结果处理得到吉富罗非鱼(F₁₆)平均Nei基因多样性(H)0.288 6，其中以E-AAC/M-CAG最高为0.3062，E-AGG/M-CTG最低为0.2638；平均Shannon 指数(I)0.4339，其中以E-AGG/M-CTT最高为0.4580，E-AGG/M-CTG最低为0.3883，如表2所示。

2 讨论

扩增片段长度多态性(AFLP)技术的基础是PCR技术，基因组DNA首先用两种限制性内切酶进行切割，然后将双链接头连接在DNA片段末端，引物结合位点分别为接头序列和与接头序列相邻的内切酶位点序列，两种内切酶分别为六碱基的常见切割酶和四碱基的罕见切割酶(陈清华,2005)。AFLP具有RFLP的稳定性与PCR技术的高效性，可获得丰富而稳定的遗传标记,因此其被认为是理想的分子标记技术之一 ,现已广泛的应用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、系统进化与分类学、遗传育种与种质鉴定等方面。

多态位点比例是衡量群体多样性的一个重要指标。本实验利用5对引物组合共得到187个位点，其中多态性位点163个，多态位点比例为87.17%，说明选育群体存在较丰富的遗传多样性。王志勇等(王志勇等,2002)利用5对引物组合对福建官井洋大黄鱼野生种群和2个养殖群体进行研究得到的多态位点比例分别为76.6％，70.6％，69.2％；匡友谊等(匡友谊等,2007)利用12对引物组合对黑龙江水系呼玛河塔河河段呼玛河哲罗鱼进行研究获得的多态位点比例为84.43%。本实验所获得的遗传多态性略高于以上鱼类，主要原因可能与本研究所用的吉富罗非鱼群体在选育过程中严格控制近亲繁殖有关。但是，颉晓勇等(颉晓勇等,2011)利用AFLP标记对吉富罗非鱼遗传变异进行了研究，得到F₀ 代多态位点比例为51.13%, F₆ 代为48.17%, F₇ 代为47.11%, F₈ 代为46.11%, F9代为43.18%，呈现出下降趋势，与本实验所得结果有差异，这可能与所选实验群体的选育方法及所选引物和图片处理方法不同有关。

Nei's基因多样性(H)又称遗传杂合度，是各个位点的平均杂合度，能够反映各群体在几个位点上的遗传变异，一般认为它是一个较适合度量群体遗传变异的参数(宋红梅等,2008)。本实验，吉富罗非鱼(F₁₆)群体的平均Nei's基因多样性为0.288 6。平均Shannon’s指数(I)为0.4339。这都明显高于李莉好等(李莉好等,2007)对吉富罗非鱼不同选育群体的遗传多样性所做研究获得的结果，表明所选实验群体保持有较高的遗传杂合度，具有进一步育种和开发的价值。

3 材料与方法

3.1 样品来源

试验所用吉富罗非鱼27尾，为2011年1月在广东省化州光辉养殖场有限公司采集的第16代群体(F₁₆)。取其背部肌肉放于无水乙醇中，-20℃保存备用。

3.2 基因组DNA 的提取

基因组DNA的提取参照《现代分子生物学实验技术》(卢圣栋,1999)的苯酚/氯仿法进行，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，4℃保存备用。

3.3 AFLP分析

3.3.1 基因组DNA酶切

用限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ双酶切。首先用MseⅠ内切酶酶切，酶切反应体系如下：10×Tango Buffer 2.5 μL，MseⅠ0.5 μL(10U/μL)，DNA模板3 μL，双蒸水14.0 μL。65℃温浴3 h后，分别追加EcoRⅠ内切酶0.5 μL(10 U/μL)和双蒸水1.5 μL,37℃温浴酶切3 h，然后85℃高温失活15 min，等待连接。

3.3.2 连接反应

酶切完成后马上进行连接反应，每个反应体系为10×Buffer 2 μL，T4连接酶0.5 μL(5 U/μL)，双酶切产物10 μL，MseⅠ接头0.5 Μl(50 μmol/L)，EcoRⅠ接头0.5 μL(5 μmol/L)，加双蒸水至20 μL,20℃连接过夜。

3.3.3 AFLP预扩增反应 

将连接产物稀释10倍后用于AFLP预扩增反应，预扩增引物如下：

EcoRⅠ预扩增引物(E-p): 5’-GACTGCGTACCAATTC-3’

MseⅠ预扩增引物 (M-p): 5’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’

反应体系如下：10×PCR Buffer(含Mg²⁺) 2.5 μL，E-p 1μL(5 μmol/L)，M-p 1μL(5 μmol/L)，dNTPs 2μL(2.5 mmol/L)，连接产物(稀释10倍)4 μL，Taq酶0.2 μL(5 U/μL)，加双蒸水14.3 μL。

反应程序：首先94℃预变性2 min；然后94℃变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸60 s，进行20个循环；最后72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶检测AFLP预扩增反应结果，扩增产物4℃保存。

3.3.4 AFLP选择性扩增反应

    AFLP选择性扩增引物组合如下：E-AGG/M-CTT；E-AGG/M-CTG；E-AAC/M-CAG；E-ACA/M-CTG；E-ACA/M-CAG

反应体系如下：

10×PCR Buffer(含Mg²⁺)2.0μL， EcoRⅠ引物1.0μL(5 μmol/L)，MseⅠ引物1.0μL(5 μmol/L)，dNTPs1.5 μL(2.5 mmol/L)，预扩增产物(稀释20倍)3.0 μL，Taq酶0.2 μL(5 U/μL)，加双蒸水补足至25 μL。

AFLP选择性扩增反应程序采取“touch-down”策略，反应程序：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸60 s，进行12个循环每个循环退火温度降低0.7℃，其他条件不变。然后再进行24个循环，反应条件为94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s；最后72℃延伸10 min，扩增产物4℃保存。

3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测AFLP选择性扩增产物

AFLP选择性扩增产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染(Wang et al., 2000),用数码相机拍照。

3.5 数据统计

利用Gel-Pro analyzer 4.0软件读取电泳图，并建立1/0矩阵，有带(显性表型)记为1，无带(隐形表型)记为0。PopGene32分析观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、多态性位点比例、Nei's基因多样性指数(H)(Nei,1973)和Shannon氏指数(I)(Lewontin,1972)。

作者贡献：

燕涛：实验的具体操作以及文章的撰写；

王中铎：对本实验操作，数据处理处理以及文章撰写提供了指导与帮助；

郭昱嵩，刘 丽: 对本实验操作以及文章撰写提供了指导与帮助；

刘楚吾: 课题负责人，负责实验选题、设计，文章修改。

致谢

本研究由广东省海洋渔业科技攻关与研发项目(A201101B02；A201008C03)资助，实验材料由广东省化州市光辉养殖场有限公司提供，谨此致谢！

感谢罗杰老师在样品采集方面给予的支持与帮助。

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